栽培双孢蘑菇的最佳的原材料是稻草或麦草配以一定量的氮肥（畜禽粪、有机复合肥、饼肥、米糠和麸皮以及部分化肥），如果在稻草、麦草缺少的情况下，可以增加5～10%少量的玉米秸（应先截短、预湿）和5～10%棉籽壳（要预处理），但是无论怎样配都要严格考虑培养料的碳氮比，配制时以30～33∶1为合适，堆制发酵后的碳氮比应为17～18∶1碳氮比是微生物（包括菌菇类）生长发育所需要的碳源和氮源的比例。从生理作用上讲，碳源主要供应微生物生长发育所需要的能量；氮源主要参与微生物蛋白质合成，变成微生物内部的构造物质。对微生物的生长发育来说，培养料中的碳氮比相当重要，特别对于双孢蘑菇的栽培来说，显得更为重要。如果掺加了玉米芯和棉籽壳在培养料堆制的操作上应作适当调整。

培养料配制时，还应注意粪草比不能超5∶5以6∶4为宜，如加尿素，尿素量不能超总量的1%，且在预堆时就加进去。目前个别地区用纯棉壳也已栽培出双孢蘑菇，这种方法在我国棉花主产区的新疆用得较多，但至今未见公开的文章发表。